Ostéosarcome, Microenvironnement tumoral, Immunité innée, Neutrophiles circulants, Neutrophiles infiltrants, Dégranulation, NETose, Single cell RNA sequencing, Immunohistochimie multiplex, Immunothérapie

L'ostéosarcome est le sarcome osseux de haut grade le plus fréquent qui touche principalement les adolescents et les adultes jeunes. Son traitement consiste en une polychimiothérapie et une résection chirurgicale extensive, cependant sa survie reste relativement inchangée depuis les années 1980 malgré les essais cliniques récents de thérapies ciblées, immunothérapies ou traitements basés sur les « Chimeric Antigen Receptor - T cells ». Cet échec d'immunomodulation peut être expliquée par le caractère « froid » de l'ostéosarcome : l'analyse immunohistochimique a montré que les lymphocytes T CD8+ représentaient 1% des cellules de tumeurs primitives, et que le marquage PD1/PDL-1 était absent dans plus de 80% des cas. Récemment, le ratio neutrophiles/lymphocytes a été identifié comme un facteur pronostic dans l'ostéosarcome. Les neutrophiles sont des cellules clés de l'immunité innée ; dans le contexte tumoral, les neutrophiles circulants et infiltrants influencent tous les stades de la maladie, de l'initiation tumorale aux métastases. Le rôle des neutrophiles reste encore largement méconnu dans l'ostéosarcome et aucune observation directe des neutrophiles infiltrants de la tumeur primitive n'a été réalisée à ce jour. Nous avons fait l'hypothèse que l'ostéosarcome modifie les profils transcriptomiques des neutrophiles circulants et infiltrants, entraînant des changements fonctionnels, responsables du remodelage du microenvironnement tumoral. Dans cette étude, nous avons confirmé la présence des neutrophiles infiltrants CD66b+ dans le microenvironnement de l'ostéosarcome humain, et validé le modèle murin intratibial pour leur analyse. Dans ce modèle murin, les neutrophiles infiltrants étaient identifiés par immunohistochimie avec un anticorps anti-Ly6G, et ils représentaient 16,6% des cellules dans les tumeurs par quantification par FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). En condition tumorale, la proportion des neutrophiles circulants étaient augmentée (p=0,0023), passant de 21,4% (95% CI 9-34) chez les souris contrôles à 54,4% (95% CI 42-67) chez les souris avec tumeur. De même, le nombre de neutrophiles dans la moëlle osseuse (MO) était augmenté (p=0.0084), passant de 36% (95% CI 29-43) à 49% (95% CI 44-54%). L'analyse transcriptomique de 33943 neutrophiles de la moëlle osseuse (MO), sang et tumeur en condition contrôle ou tumeur a montré des profils similaires entre les deux conditions dans la MO, différents entre les deux conditions dans le sang, et uniques dans la tumeur. Les neutrophiles circulants en condition tumeur avaient une activation des voies liées aux lymphocytes T, et les neutrophiles infiltrants avaient une activation des réponses à l'inflammatoire et aux cytokines, ce qui en faisaient des effecteurs spécialisés. Enfin, l'analyse de trajectoire cellulaire a confirmé que les neutrophiles infiltrants résultaient d'une maturation passant par la MO et le sang. L'analyse fonctionnelle des neutrophiles infiltrants par immunohistochimie multiplex a montré que les neutrophiles Ly6G+ ayant dégranulé, dépourvus de myélopéroxydase (MPO), étaient présents dans les zones de prolifération tumorale, alors que les neutrophiles ayant effectué la NETose (Neutrophil Extracellular Trap), mise en évidence par la colocalisation de Ly6G, MPO, histone 3 citrullinée et DAPI, étaient au contact des cellules tumorales apoptotiques, dans les zones de nécrose tumorale. Des macrophages infiltrants F4/80+ étaient également présents, alors que les lymphocytes T CD3+ étaient rares. Nous avons ainsi confirmé la présence des neutrophiles infiltrants dans la tumeur primitive d'ostéosarcome chez l'homme et chez la souris. Ces effecteurs spécialisés étaient associés soit à la prolifération tumorale par dégranulation, soit à la nécrose tumorale via la NETose. Nos résultats soulignent l'implication des neutrophiles dans la progression de l'ostéosarcome, ouvrant la voie à de nouvelles cibles potentielles d'immunothérapies.