Vésicules extracellulaires, Sécrétome, Cellules souches mésenchymateuses, Caractérisation, Qualité, Réglementation, Stabilité, Variabilité, Turbulence

Le sécrétome de cellules souches mésenchymateuses (CSMs) est composé de facteurs solubles et de vésicules extracellulaires (VEs) médiant un effet paracrine dans leur rôle d'immunomodulation et de régénération. Comparativement aux cellules elles-mêmes, l'utilisation de ce sécrétome s'est révélée moins immunogène et moins tumorigène, ce qui en fait une thérapie prometteuse pour de nombreuses maladies. Cependant, leur production à grande échelle et leur mise sur le marché selon la réglementation comporte de nombreux enjeux. En parallèle du développement d'un procédé de production massif et extensible, basé sur la turbulence et répondant aux Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF), l'établissement de contrôles qualité (CQs) est essentiel pour la production industrielle d'un sécrétome enrichi en VEs. Pour cela, la réglementation européenne exige l'utilisation de méthodes analytiques validées et certifiées selon l'ICH Q2(R2) afin de déterminer chaque attribut qualité (AQ) du produit. Actuellement, aucune réglementation n'est définie pour l'utilisation clinique des VEs, mais des recommandations ont néanmoins été publiées pour standardiser leur étude. La méthode NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) a été validée ici pour quantifier la concentration et la taille en particules totales, correspondant à l'AQ « quantité ». Sa gamme de travail, comprenant la linéarité et les limites de détection et quantification ; sa justesse, d'après un matériel de référence en silice, physico-chimiquement proche des caractéristiques des VEs ; et sa précision, comprenant à la fois la répétabilité, la fidélité intermédiaire et la reproductibilité inter laboratoire, ont été évaluées. De même, le kit MACSPlex EV, permettant la détection de 39 marqueurs de VEs par cytométrie en flux, a été validé pour déterminer le phénotype des VEs, répondant à l'AQ « identité » et partiellement à l'AQ « pureté ». Enfin, un test fonctionnel in vitro, le scratch test, a été optimisé pour évaluer les capacités angiogéniques et régénératives du sécrétome enrichi en VEs, répondant à l'AQ « activité biologique ». Grâce à ce panel de méthodes, une étude de la stabilité du sécrétome et de la variabilité inter-lot a été menée afin d'établir les premières spécifications associées au produit. Les résultats ont montré une forte influence de la température et du temps de conservation. Un stockage à 4ºC à court-terme a permis de réduire l'impact du premier cycle de congélation délétère au produit. Cependant, au-delà d'une semaine de stockage, une congélation à -80ºC était nécessaire, les cycles de congélation décongélation restant néanmoins à éviter. En outre, la méthode d'isolation utilisée pour concentrer le produit s'est avérée déterminante pour les propriétés finales du sécrétome. L'ultracentrifugation a conduit à une absence d'effet thérapeutique in vitro et une instabilité plus forte du sécrétome aux cycles de congélation, comparé à une concentration par filtration à flux tangentiel. D'autre part, l'ajout de la turbulence en 3D s'est avérée produire un sécrétome au profil différent mais efficace in vitro, en comparaison à une carence en sérum traditionnelle en flasques. Un enrichissement en marqueurs de CSMs a particulièrement été observé pour les productions en turbulence en bioréacteurs de 10L. Ces résultats doivent être couplés à des tests d'immunomodulation, de toxicité mais aussi à une vérification des impuretés et des tests de stérilité. La détermination du mode d'action du sécrétome, couplé à une caractérisation précise du produit en lien avec le procédé de production, permettra de déterminer une dose en corrélation avec les résultats in vitro et in vivo. Cette étude est une des rares initiatives réduisant l'écart vers la conformité réglementaire du CQ des VEs dans le but d'accélérer les essais cliniques. Les futures étapes devront être guidées par une analyse de risques et le Quality by Design conforme aux BPF pour répondre efficacement aux enjeux réglementaires.