PARylation, Réplication de l'ADN, Stress réplicatif, PARP1, PARG, Inhibiteurs de PARP, Inhibiteurs de PARG

Grâce à l'action simultanée des enzymes PARP (synthèse) et PARG (dégradation), la PARylation (PAR) est une modification post-traductionnelle hautement dynamique des protéines, ce qui en fait une forme efficace de signalisation moléculaire, en particulier dans le noyau. Le recrutement de protéines, principalement via la protéine PARP1 autoPARylée, a été décrit dans la détection et la réparation des dommages à l'ADN, la compaction de la chromatine et la régulation de la transcription. Une accumulation de travaux suggère aujourd'hui que la PAR et la protéine PARP1 jouent un rôle dans le processus de réplication de l'ADN, principalement au niveau des fourches de réplication bloquées. Des travaux récents ont également montré que la dérégulation de la PAR peut affecter la réplication de l'ADN et induire une instabilité génomique. Cependant, les mécanismes moléculaires associés restent peu clairs jusqu'à présent. Les inhibiteurs de PARP (PARPi) sont actuellement utilisés pour traiter certains cancers du sein et de l'ovaire mutés BRCA1-2 en amplifiant l'instabilité génétique, ce qui entraîne la mort cellulaire. Cependant, la cause de l'instabilité induite par ces inhibiteurs reste controversée et des cas de résistance au cancer peuvent apparaître. Les inhibiteurs de PARG (PARGi) sont moins décrits mais montrent des résultats prometteurs pour le traitement du cancer. Dans ce contexte, mon projet de thèse vise à comprendre comment une dérégulation de la PAR influence la dynamique de la réplication de l'ADN en utilisant des inhibiteurs de PARP et de PARG dans des cellules humaines. En utilisant des approches moléculaires et omiques, j'ai dans un premier temps observé les PARPi et PARGi retardent la progression de la phase S, induisent un stress réplicatif, diminuent la synthèse de l'ADN et provoquent des modifications du programme temporel de la réplication de l'ADN à l'échelle du génome. J'ai ensuite cherché à comprendre les effets de ces inhibiteurs sur la réplication au niveau moléculaire. Une analyse des protéines localisées à la chromatine pendant la phase S après traitements PARPi ou PARGi a montré une diminution de certaines protéines du pré-IC, suggérant un effet de ces inhibiteurs sur l'activation des origines de réplication, et a également montré une diminution de PCNA monoubiquitinée, suggérant un impact sur la synthèse translésionnelle de l'ADN. En outre, par des expériences iPOND combinées à la spectrométrie de masse, j'ai montré que la composition du réplisome est modifiée par la dérégulation de la PAR induite par ces inhibiteurs. En particulier, j'ai observé une diminution significative des protéines FANCD2-FANCI-BRCA1-BARD1-RAD18, connues pour être impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN. Enfin, par des tests de comète en conditions alcalines ou neutres, j'ai observé une accumulation de cassures simple-brin en fin de G1 et de cassures double-brin au cours de la phase S dans des cellules traitées par PARPi ou PARGi. Notre modèle actuel est qu'une dérégulation de la PAR aurait deux effets génotoxiques dans les cellules au cours de la phase S. Premièrement, les PARPi ou PARGi entraînent une accumulation de cassures simple-brin sur l'ADN matrice, très certainement car ces cassures endogènes à notre lignée cellulaire modèle ne sont pas réparées efficacement par le SSBR lorsque la PAR est dérégulée. Ensuite, au cours de la phase S, une dérégulation de la PAR induit une diminution des protéines FANC/BRCA au sein du réplisome, ce qui pourrait altérer la protection de la fourche réplicative lors de la rencontre avec ces cassures simple-brin présentes dans l'ADN matrice. Ces deux effets combinés pourraient affecter la progression des fourches réplicatives et expliquer le stress réplicatif généré par ces inhibiteurs. Ces travaux ont permis d'apporter des connaissances supplémentaires sur les effets génotoxiques des inhibiteurs de PARP et PARG au cours de la réplication de l'ADN dans des cellules cancéreuses humaines.