Néoplasmes myéloprolifératifs, TP53, CRISPR/Cas9, CALRdel52, P53, IPSC

Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des maladies clonales des cellules souches hématopoïétiques, entraînant une prolifération accrue d'une ou plusieurs lignées myéloïdes, avec une maturation efficace. Les NMP sont dues à des mutations motrices dans les gènes JAK2, calréticuline (CALR) ou récepteur de la thrombopoïétine (MPL) qui entraînent une activation constitutive de l'axe récepteur de cytokine JAK2/STAT et une myéloprolifération. Les mutants de CALR se lient, s'oligomérisent sur MPL et activent la voie JAK2/STAT à la surface des cellules. Chez les patients atteints de NMP, l'apparition de mutations somatiques, de pertes d'hétérozygotie et/ou de délétions dans le gène suppresseur de tumeur TP53 est associée à un risque accru de transformation en leucémie myéloïde aiguë. Des lignées iPSC dérivées d'un individu sain et d'un patient atteint de MPN, ont été génétiquement éditées dans le gène TP53 par CRISPR/Cas9. Pour le Knock-out (KO), le sgARN spécifique de l'exon 5 a été cloné dans un vecteur exprimant la Cas9 et le marqueur GFP. Pour le Knock-in (KI) de la mutation R175H, un complexe RNP a été utilisé un plasmide contenant la séquence donneuse et le marqueur Cherry. Les clones ont été criblés par PCR suivie d'une digestion enzymatique et l'édition a été analysée par séquençage. Pour évaluer la fonction de p53, des iPSC ont été traitées avec de la nutline, puis l'expression et la phosphorylation de la protéine p53. Pour évaluer le potentiel leucémique, des cellules hématopoïétiques provenant de clones CALRdel52/p53KO ont été injectées par voie intrafémorale à des souris immunodéficiences NOD-SCID. Le traitement des modèles iPSC TP53WT par la nutline a conduit à la stabilisation et à la phosphorylation de p53 et à une augmentation de l'expression des gènes cibles. Les mutants TP53 R175H n'était pas exprimé au niveau protéique, ce qui a entraîné une absence de p53 (p53KO). Les fonctions de p53 ont été sévèrement inhibées dans les iPSCs porteurs des mutations de TP53/p53KO. L'impact des mutations sur l'hématopoïèse, nous avons constaté que CALRdel52, indépendamment de l'édition du gène TP53, induisait une augmentation du pourcentage de progéniteurs hématopoïétiques et mégacaryocytaires et de mégacaryocytes matures au cours de la différenciation hématopoïétique. L'édition du gène TP53 dans CALRWT a conduit à une augmentation du nombre de colonies myéloïdes tandis qu'en coopération avec CALRdel52, elle a augmenté à la fois le nombre de progéniteurs myéloïdes et mégacaryocytaires par rapport à leur contrôle isogénique. Ces progéniteurs CALRdel52 édités pour TP53 sont restés indépendants de la thrombopoïétine et ont pu générer un nombre accru de mégacaryocytes dans des cultures liquides. L'haploinsuffisance de TP53 n'a pas affecté le nombre de progéniteurs par rapport à CALRdel52, CALRdel52/p53KO a montré le phénotype d'amplification le plus frappant avec la présence de grandes colonies multipotentes de CFU-GEMM. Au 20ième jour de culture, nous avons observé que les modèles CALRdel52 /TP53 et en particulier les clones p53KO présentaient mégacaryocytes immatures et de cellules hématopoïétiques capables de proliférer en milieu liquide en présence ou en absence de TPO et de générer des colonies en milieu semi-solide par rapport à CALRdel2. CALRdel52/p53KO est actuellement étudié après leur transplantation chez des souris immunodéficientes ; une souris présentant des signes de prise de greffe humaine est suivie par cytométrie de flux en utilisant l'anticorps hCD45. La coopération des mutations CALRdel52/TP53 induit l'amplification des progéniteurs hématopoïétiques immatures et potentialise la mégacaryopoïèse. La modulation des effets hématopoïétiques est inversement corrélée au degré d'inactivation de TP53 dans le contexte CALRdel52, l'absence totale de p53 présentant le phénotype le plus marqué. Dans l'ensemble, nos travaux soulignent que la perte de fonction de p53 contribue à la dérégulation de l'hématopoïèse immature.