Cristaux d'urate, Pyrophosphate, Goutte, Chondrocalcinose, IL-1ß, NLRP3, VRAC/LRRC8, Osmolarité, Inflammasome

Les cristaux d'urate monosodique (MSU) et de pyrophosphate de calcium (CPP) sont responsables d'arthrite récidivante dépendante de l'interleukine (IL)-1b. La production de l'IL-1b mature dépend de l'inflammasome NLRP3, qui peut être activé par d'autres stimuli tels que l'hypoosmolarité et l'ATP. Lors d'un stress hypotonique extracellulaire, l'influx d'eau osmotiquement induit entraîne un gonflement cellulaire qui est suivi d'une réaction cellulaire de décroissance volumique appelée Regulatory Volume Decrease (RVD). Celle-ci conduit à l'extrusion des ions K+/Cl- et par conséquent de l'eau et la réduction du volume cellulaire. La réponse RVD dépend du canal anionique VRAC, un canal hétéro-hexamérique composé des membres de la famille LRRC8. LRRC8A est nécessaire pour former un canal VRAC actif. Dans cette étude, nous avons évalué le rôle du canal LRRC8/VRAC dans la régulation du volume cellulaire et la libération d'IL-1b induite par les cristaux MSU et CPP. In vivo, nous avons augmenté artificiellement l'osmolarité plasmatique des souris par injection intrapéritonéale de mannitol 20% (Pos=~1050 mOsm.l-1), un osmolyte non chargé. Après 3 jours consécutifs d'injection de mannitol, l'osmolarité du plasma était augmenté à 321 mOSM.l-1, tandis que celle du groupe PBS était normale (298 mOsm.l-1). Le traitement par mannitol a fortement réduit l'inflammation induite par les microcristaux en diminuant le score de l'inflammation de la membrane de la poche à air, le nombre de cellules recueillies et la concentration d'IL-1b. Pour réguler l'osmolarité et le volume cellulaire, les cellules facilitent les échanges d'eau à travers des canaux d'aquaporine. Nous avons utilisé du chlorure de mercure (HgCl2) pour bloquer les aquaporines. L'inhibition des aquaporines diminuait la production d'IL-1b par les cellules monocytes de la lignée THP-1 et les macrophages murins dérivés de la moelle osseuse (BMDM) après stimulation microcristalline. Le traitement par HgCl2 a également diminué l'activation de l'inflammasome NLRP3 et du facteur de transcription NF-kB induite par les microcristaux sans augmenter la mort cellulaire. In vitro, nous avons constaté que l'inhibition du canal VRAC soit par un inhibiteur pharmacologique (DCPIB) soit par ARN interférence (shRNA) diminuait l'activation de NF-kB induite par les cristaux de MSU et de CPP. De même, la production d'IL-1b induite par les microcristaux était réduite en présence de DCPIB (MSU 5200 versus 1080 pg/ml; CPP 11500 versus 4980, p<0.0001) et dans les cellules shLRRC8A comparativement aux cellules sauvages. La stimulation par les cristaux MSU et CPP induisait un changement biphasique du volume cellulaire caractérisé par une augmentation initiale suivie d'un phénomène semblable au RVD. La réduction du volume cellulaire était inhibée en présence de DCPIB et dans les cellules THP-1 shLRRC8A. In vivo, la délétion de Lrrc8A dans la lignée macrophagique (Cxcr3Cre_Lrrc8aflox/flox) diminuait l'inflammation microcristalline avec une réduction du score inflammatoire, de l'infiltrat cellulaire et de la production de l'IL-1b. De plus, les BMDM isolés des souris Cx3Cr1_CreERT2/Lrrc8Afl/fl exprimaient moins de Lrrc8A et produisaient moins d'IL- 1 par rapport aux BMDM isolés des souris sauvages. Enfin, nous avons observé que le stress hypotonique et les cristaux de MSU et de CPP induisaient une libération significative d'ATP dans le milieu de culture. Cette libération d'ATP était fortement inhibée en présence de DCPIB ou dans les cellules THP-1 shLRRC8A, suggérant un rôle majeur de LRRC8 dans la libération de ATP. L'inhibition du récepteur purinergique P2Y6 diminuait, in vitro et in vivo, la production de l'IL-1b induite par les cristaux. Nous avons identifié des fonctions nouvelles et inattendues du canal anion LRRC8/VRAC avec une pertinence pathophysiologique claire dans le contexte de l'inflammation induite par les cristaux.