| Resumé |
L'étude des mécanismes épigénétiques permet notamment de comprendre comment la diversité phénotypique émerge au cours de la différentiation cellulaire. En effet, bien que toutes les cellules d'un même organisme partagent la même séquence d'ADN, des modifications de la chromatine régulent l'expression des gènes, et ces modifications épigénétiques sont mitotiquement transmises afin de maintenir l'identité cellulaire. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs facteurs ont été identifiés comme des acteurs clés chargés de déposer, effacer ou interpréter ces marques épigénétiques. La perte de ces facteurs est souvent létale lors du développement embryonnaire, et peut contribuer aux processus tumoraux dans les cellules somatiques. C'est dans ce contexte que nous avons imaginé une approche systématique afin d'identifier de nouvelles protéines impliquées dans la régulation de l'expression génique, au travers d'un crible ciblant le génome codant des cellules souches embryonnaires murines avec la technologie CRISPR/Cas9. Premièrement, nous avons inséré un système rapporteur dans un gène, Dazl, dont l'expression dépend de marques épigénétiques au promoteur. Ce système rapporteur permet la sélection des cellules qui expriment Dazl ; ceci n'est pas le cas dans les conditions de culture habituelles, à moins qu'une perturbation des mécanismes de répression épigénétique n'ait lieu. C'est ce type de perturbation que notre crible produit, à travers l'invalidation (knock-out, KO) d'un autre gène. Les cellules rapportrices ayant survécu à la sélection sont donc celles dans lesquelles le KO a concerné un facteur réprimant Dazl. A l'issue du crible, nous avons décidé de concentrer notre attention sur cinq candidats aux fonctions diverses. Pour comprendre comment BEND3 réprime épigénétiquement Dazl, nous avons généré plusieurs jeux de données « omiques » (RNA-seq, ChIP-seq, WGBS) dans les cellules Bend3 KO. Ces expériences nous ont amené à conclure que BEND3 est un facteur nécessaire à la répression de l'expression des gènes via le recrutement de complexes protéiques qui déposent des marques épigénétiques répressives sur la chromatine de ses cibles. Contrairement à BEND3, les quatre autres candidats (SPOP, KDM5C, ZBTB14, MCM3AP) avaient un profil très similaire : le KO de chacun de ces quatre facteurs a mené au même état cellulaire, différent de celui des cellules parentales. La caractérisation plus poussée de ces cellules KO a montré qu'elles avaient non plus une identité pluripotente mais plutôt totipotente (appelé 2CLC). Plusieurs expériences fonctionnelles ont révélé que ces quatre protéines a priori indépendantes convergent pour réprimer DUX, un facteur essentiel à l'établissement de l'état totipotent. En conclusion, nous avons établi une lignée rapportrice versatile qui nous a permis d'identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la répression épigénétique et dans le maintien de la pluripotence des cellules souches embryonnaires murines. |