Ostéoporose d'apparition précoce, Zebrafish, CRISPR-Cas9, Ostéoblaste, Protéines recombinantes, LRP5, WNT11

L'ostéoporose d'apparition précoce (OP) est une maladie osseuse constitutionnelle de transmission autosomique dominante voire dominante liée à l'X. Elle se définit par une densité minérale osseuse basse qui entraîne un risque accru de fractures chez les enfants et les jeunes adultes. Bien que plusieurs gènes responsables aient été identifiés, l'étiologie génétique de cette pathologie reste non résolue dans la majorité des cas. Grâce à trois projets menés sur ce sujet, nous avons mis en évidence de nouveaux variants pathogènes et un nouveau gène responsable de l'OP. Nous avons utilisé les modèle poisson zèbre et lignées cellulaires pour comprendre les mécanismes physiopathologiques. Le premier projet visait à étudier le profil génétique des patients atteints d'OP afin de mieux comprendre la sévérité du phénotype ostéoporotique en utilisant un Séquençage Nouvelle Génération à l'aide d'un panel de gènes. Nous avons observé pour la première fois que le mode récessif explique certaines formes sévères d'OP ou encore que celle-ci peut être due au portage de 2 variants pathogènes à l'état hétérozygote dans 2 gènes différents codant pour des protéines intervenant dans la voie de signalisation Wnt, comme DKK1 et WNT3A. Les deux autres projets ont mis l'accent sur un nouveau gène d'OP, WNT11. Une analyse d'exome a révélé une mutation hétérozygote de novo dans WNT11 (NM_004626.2:c.677_678dup p.Leu227Glyfs*22) chez un enfant avec une ostéoporose fracturaire. Ensuite, nous avons également identifié 2 variants faux-sens hétérozygotes dans WNT11, (NM_004626.2:c.217G>A, p.Ala73Thr) et (NM_004626.2:c.865G>A, p.Val289Met) chez des femmes adultes qui présentaient une fragilité osseuse. Pour confirmer la pathogénicité du variant avec décalage de lecture, une lignée cellulaire U2OS porteuse de la délétion hétérozygote WNT11 (NM_c.690_721delfs*40) a été générée par la technologie CRISPR-Cas9. Cette approche a montré que la lignée U2OS mutée présentait une prolifération et une différenciation ostéoblastique diminuée significativement par rapport à la lignée cellulaire sauvage. L'expression transcriptionnelle de certains gènes des voies Wnt canoniques et non canoniques est diminuée dans les cellules mutées, mais un traitement par WNT11 recombinant restaure leur expression. En outre, l'expression de la R-spondin 2 (RSPO2), une des cibles de WNT11, impliquée dans la différenciation des cellules osseuses, ainsi que celle de son récepteur LGR5, étaient diminuées dans les cellules WNT11 mutées. Le traitement à l'aide de WNT5A et WNT11 recombinants a corrigé l'expression de LGR5, tandis que WNT3A n'a eu aucun effet. De plus, le traitement par RSPO2 recombinant, mais pas celui par WNT11 ou WNT3A, a permis d'activer la voie canonique dans les cellules WNT11 mutées. Par conséquent, nous avons découvert que WNT11, gène d'OP, est capable d'activer la voie signalisation Wnt en induisant le complexe RSPO2-LGR5 via la voie Wnt non canonique, ainsi la voie non canonique de Wnt contrôle la voie canonique. WNT11 est très conservé entre les espèces. Contrairement au génome humain, comportant une copie unique de WNT11, le zebrafish possède deux gènes: wnt11, l'orthologue humain, et wnt11f2, qui a été perdu chez les mammifères. Nous avons analysé le phénotype osseux du zebrafish silberblick (slb) qui porte une mutation inactivatrice dans wnt11f2. Le zebrafish adulte wnt11f2 (-/+) présentaient une densité minérale tissulaire significativement plus élevée que celle du zebrafish adulte sauvage. Alors que les larves wnt11f2 (-/-) présentaient une dysmorphie cranio-faciale sévère. De plus, une différence significative dans l'expression de fgf8a suggère une interaction possible entre wnt11f2 et la voie de signalisation FGF. Wnt11f2 semble jouer des rôles cruciaux dans le développement osseux. En conclusion, nous avons démontré que les voies de signalisation wnt canonique et non canonique sont nécessaires au cours de la formation et du remodelage osseux.