Formine, Fascin, Alpha-Actinine, Cofiline, Filopodia, Fibres de stress, Bicouche, Microfluidique, Microscopie de fluorescence, Microscopie de polarisation de fluorescence, Microscopie électronique

Dans la cellule, les filaments d'actine sont organisés en différents réseaux, comme les filopodes, les fibres de stress ou les lamellipodes, afin de remplir diverses fonctions. Ces réseaux sont constamment réorganisés par un grand nombre de protéines régulatrices de l'actine (ABP). La façon dont plusieurs ABP comme les formines, les crosslinkers, la cofiline et la tropomyosine travaillent en synergie pour réguler assemblage et désassemblage dans un réseau d'actine n'est pas bien comprise. Dans les filopodes, 10 à 20 filaments sont allongés principalement par les formines à leurs extrémités barbées et sont regroupés en faisceau par la fascine. On ignore comment l'activité des formines est affectée par le regroupement des filaments en faisceau. De même, bien que le désassemblage de filaments individuels par la cofiline soit maintenant assez bien compris, les détails moléculaires de la façon dont la cofiline désassemble les faisceaux de filaments restent à aborder. Dans ce travail, nous avons reconstitué in vitro des faisceaux de filaments d'actine minimaux en utilisant des protéines purifiées afin de répondre à ces questions. En fonction de la liberté de rotation fournie par son lien d'ancrage, nous avons montré que l'activité de la formine peut être fortement diminuée lors de l'élongation de filaments qui sont contraints en rotation. Pour évaluer la processivité et les taux d'élongation de la formine lors de l'élongation de filaments en faisceaux de 10 filaments ou plus, nous avons développé différentes stratégies pour ancrer de nombreuses formines actives sur des vésicules unilamellaires géantes (GUV), des billes recouvertes de lipides et des bicouches lipidiques supportées plates (SLB). Nous les avons utilisées dans des essais microfluidiques. Nous avons observé que les formins sont très sensibles aux forces de poussée, rendant les observations difficiles. Nous avons quantifié les différentes étapes du désassemblage des faisceaux de filaments d'actine induit par la cofiline avec deux types de crosslinker, l' alpha-actinine et la fascine. en utilisant plusieurs approches expérimentales (microfluidique, imagerie par fluorescence, microscopie à polarisation de fluorescence et microscopie électronique). Nous avons pu établir plusieurs résultats originaux. Tout d'abord, le désassemblage des faisceaux par la cofiline, qui dépendent du taux de nucléation des domaines de cofiline, de leur vitesse de croissance et de leur taux de fragmentation, sont différents pour les faisceaux induits par fascine ou l alpha-actinine. D'autre part, la nucléation plus lente des domaines de cofiline sur les faisceaux induits par la fascine que sur les filaments individuels ne peut pas être attribuée à une pure gêne stérique dû à la présence des molécules de fascine sur les filaments d'actine. La capacité de l alpha-actinine à se lier à des filaments d'actine individuels diminue la formation de domaines de cofiline, contrairement à la très faible affinité de la fascine pour les filaments individuels. Enfin, sur la base de nos observations, nous proposons un modèle pour détailler les étapes impliquées dans la fragmentation des faisceaux : la croissance d'un premier domaine de cofiline sur un faisceau de cofiline, en modifiant la torsion des filaments d'actine peut accélérer la nucléation d'autres domaines de cofiline qui chevauchent spatialement le premier. Ces domaines de cofiline finissent par fragmenter les filaments individuels d'un faisceau pour conduire à sa fragmentation complète.